Dithiothreitol (DTT) ist ein häufig verwendetes Reduktionsmittel, auch bekannt als der neue grüne Zusatzstoff.Es handelt sich um eine niedermolekulare organische Verbindung mit zwei Mercaptangruppen (-SH).Aufgrund seiner reduzierenden Eigenschaften und Stabilität wird DTT häufig in biochemischen und molekularbiologischen Experimenten eingesetzt.
Die Hauptaufgabe von DTT besteht darin, Disulfidbindungen in Proteinen und anderen Biomolekülen zu reduzieren.Die Disulfidbindung ist ein wichtiger Teil der Proteinfaltung und -stabilität, aber unter bestimmten experimentellen Bedingungen, wie z. B. reduzierbarer SDS-PAGE-Analyse, Proteinrekombination und -faltung, ist es notwendig, die Disulfidbindung auf zwei Thiolgruppen zu reduzieren, um die räumliche Struktur aufzuklären das Protein.DTT kann mit Disulfidbindungen reagieren, um diese zu Mercaptangruppen zu reduzieren, wodurch die räumliche Struktur des Proteins geöffnet wird und es einfacher zu analysieren und zu manipulieren ist.
DTT kann auch zum Schutz der Enzymaktivität und -stabilität verwendet werden.Bei einigen enzymkatalysierten Reaktionen kann die Aktivität des Enzyms durch das Oxidationsmittel verringert werden.DTT kann mit Oxidationsmitteln reagieren, um diese zu harmlosen Substanzen zu reduzieren und so die Aktivität und Stabilität des Enzyms zu schützen.
Im Vergleich zu herkömmlichen Reduktionsmitteln wie β-Mercaptoethanol (β-ME) gilt DTT als sichereres und stabileres Reduktionsmittel.Es ist nicht nur in wässriger Lösung stabil, sondern behält seine reduzierenden Eigenschaften auch unter hohen Temperaturen und Säure-Base-Bedingungen.
Die Verwendung von DTT ist relativ einfach.Im Allgemeinen wird DTT in einem geeigneten Puffer gelöst und dann dem Versuchssystem hinzugefügt.Die optimale DTT-Konzentration muss entsprechend dem jeweiligen Experiment bestimmt werden und liegt im Allgemeinen im Bereich von 0,1–1 mM.Niedrigere Konzentrationen können nachteilige Auswirkungen auf das Zellwachstum verringern und die Zytotoxizität aufgrund der Überexpression von Zielproteinen verringern.Höhere Konzentrationen können zu einer übermäßigen Stoffwechselbelastung der Zellen führen und das Zellwachstum und die Expressionseffizienz beeinträchtigen.
Um die optimale Konzentration zu bestimmen, kann das Expressionsniveau des Zielproteins durch die Durchführung von IPTG-Induktionstests bei verschiedenen Konzentrationen ermittelt werden.Kulturtests im kleinen Maßstab können mit einer Reihe von IPTG-Konzentrationen (z. B. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM usw.) durchgeführt werden, und der Expressionseffekt bei verschiedenen Konzentrationen kann durch Nachweis des Expressionsniveaus des Zielproteins (z. B. Western) bewertet werden Blot- oder Fluoreszenzdetektion).Den experimentellen Ergebnissen zufolge wurde die Konzentration mit der besten Expressionswirkung als optimale Konzentration ausgewählt.
Darüber hinaus können Sie auch auf die einschlägige Literatur oder die Erfahrungen anderer Labore zurückgreifen, um den häufig verwendeten IPTG-Konzentrationsbereich unter ähnlichen Versuchsbedingungen zu verstehen und ihn dann entsprechend den experimentellen Anforderungen zu optimieren und anzupassen.
Es ist wichtig zu beachten, dass die optimale Konzentration je nach Expressionssystem, Zielproteinen und Versuchsbedingungen variieren kann. Daher ist es am besten, sie von Fall zu Fall zu optimieren.
Zusammenfassend ist DTT ein häufig verwendetes Reduktionsmittel, das zur Reduzierung von Disulfidbindungen in Proteinen und anderen Biomolekülen sowie zum Schutz der Enzymaktivität und -stabilität eingesetzt werden kann.Es wird häufig in biochemischen und molekularbiologischen Experimenten eingesetzt.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 28.09.2023