IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) ist ein Analogon des β-Galactosidase-Substrats und stark induzierbar. Unter IPTG-Induktion bildet der Induktor einen Komplex mit dem Repressorprotein. Dadurch ändert sich die Konformation des Repressorproteins, sodass es nicht mehr an das Zielgen binden kann und dieses effizient exprimiert wird. Wie sollte also die IPTG-Konzentration im Experiment bestimmt werden? Ist eine höhere Konzentration immer besser?
Zunächst zum Prinzip der IPTG-Induktion: Das Lactose-Operon (Element) von E. coli enthält drei Strukturgenen, Z, Y und A, die für β-Galactosidase, Permease bzw. Acetyltransferase kodieren. lacZ hydrolysiert Lactose zu Glucose und Galactose oder zu Allolactose; lacY ermöglicht den Übertritt von Lactose aus der Umgebung durch die Zellmembran in die Zelle; lacA überträgt die Acetylgruppe von Acetyl-CoA auf β-Galactosid und neutralisiert so dessen toxische Wirkung. Zusätzlich gibt es eine Operatorsequenz O, eine Startsequenz P und ein regulatorisches Gen I. Das Gen I kodiert für ein Repressorprotein, das an Position O der Operatorsequenz bindet und dadurch das Operon (Meta-Operon) reprimiert und abgeschaltet wird. Zudem befindet sich oberhalb der Startsequenz P eine Bindungsstelle für das katabolische Genaktivatorprotein (CAP). Die Sequenz P, die Sequenz O und die CAP-Bindungsstelle bilden zusammen die regulatorische Region des lac-Operons. Die kodierenden Gene der drei Enzyme werden durch dieselbe regulatorische Region reguliert, um die koordinierte Expression der Genprodukte zu gewährleisten.
In Abwesenheit von Laktose befindet sich das lac-Operon (meta) im reprimierten Zustand. In diesem Zustand bindet der vom I-Sequenz unter der Kontrolle der PI-Promotorsequenz exprimierte lac-Repressor an die O-Sequenz. Dies verhindert die Bindung der RNA-Polymerase an die P-Sequenz und hemmt somit den Beginn der Transkription. Bei Anwesenheit von Laktose kann das lac-Operon (meta) induziert werden. In diesem Operon-System (meta) ist der eigentliche Induktor nicht die Laktose selbst. Laktose gelangt in die Zelle und wird durch β-Galaktosidase zu Allolaktose katalysiert. Letztere bindet als Induktormolekül an das Repressorprotein und verändert dessen Konformation. Dies führt zur Dissoziation des Repressorproteins von der O-Sequenz und somit zur Transkription. Isopropylthiogalactosid (IPTG) hat denselben Effekt wie Allolaktose. Es handelt sich um einen sehr starken Induktor, der von Bakterien nicht verstoffwechselt wird und sehr stabil ist, weshalb er in Laboren weit verbreitet ist.
Wie lässt sich die optimale IPTG-Konzentration bestimmen? Nehmen wir E. coli als Beispiel.
Der gentechnisch veränderte E. coli BL21-Stamm mit dem positiven rekombinanten pGEX (CGRP/msCT) wurde in LB-Flüssigmedium mit 50 μg/ml Ampicillin inokuliert und über Nacht bei 37 °C kultiviert. Diese Kultur wurde im Verhältnis 1:100 in 10 Flaschen mit je 50 ml frischem LB-Flüssigmedium mit 50 μg/ml Ampicillin für die Expansionskultur inokuliert. Bei einer OD600 von 0,6–0,8 wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 und 1,0 mmol/l zugegeben. Nach der Induktion bei gleicher Temperatur und gleicher Zeit wurden 1 ml der Bakterienlösung entnommen, die Bakterienzellen durch Zentrifugation gesammelt und einer SDS-PAGE unterzogen, um den Einfluss unterschiedlicher IPTG-Konzentrationen auf die Proteinexpression zu analysieren und anschließend die IPTG-Konzentration mit der größten Proteinexpression auszuwählen.
Nach Experimenten wird sich zeigen, dass die IPTG-Konzentration nicht so hoch wie möglich sein sollte. Dies liegt daran, dass IPTG eine gewisse Toxizität gegenüber Bakterien aufweist. Eine zu hohe Konzentration führt zum Zelltod. Generell ist es wünschenswert, dass möglichst viele lösliche Proteine in den Zellen exprimiert werden. In vielen Fällen führt eine zu hohe IPTG-Konzentration jedoch zur Bildung zahlreicher Einschlüsse, wodurch die Menge an löslichen Proteinen abnimmt. Daher ist eine möglichst niedrige IPTG-Konzentration oft nicht optimal.
Ziel der Induktion und Kultivierung gentechnisch veränderter Stämme ist die Steigerung der Ausbeute des Zielproteins und die Senkung der Kosten. Die Expression des Zielgens wird nicht nur durch stammspezifische Faktoren und das Expressionsplasmid beeinflusst, sondern auch durch externe Faktoren wie die Konzentration des Induktors, die Induktionstemperatur und die Induktionsdauer. Daher empfiehlt es sich generell, vor der Expression und Aufreinigung eines unbekannten Proteins die Induktionsdauer, -temperatur und IPTG-Konzentration zu untersuchen, um die optimalen Bedingungen für beste experimentelle Ergebnisse zu ermitteln.
Veröffentlichungsdatum: 31. Dezember 2021